Kvantifikace NAD+ a jeho metabolitů v myších ischiatických nervech
Úvod
Klíčové složky nikotinamidu-adeninindinokleotidu (NAD+) a jeho metabolitů při stárnutí a neurodegeneraci byly široce uznávány. Pro podpoření pokroku v biochemickém výzkumu a intervencích zaměřených na stárnutí a neurodegenerativní onemocnění je velmi důležité přesně kvantifikovat NAD+ a jeho hladiny metabolitů v záchranné dráze NAD+. Zde je použita robustní a přesná metoda LC-MS/MS, která kvantifikuje hladiny NAD+ a jeho metabolitů v normálním a poraněném myším sedacím nervu.Omezení stávajících metod kvantifikace NAD+ a jeho metabolitů
Tradiční metody kvantifikace NAD+ a jeho metabolitů, jako jsou HPLC-UV, NMR, kapilární zónová elektroforéza nebo kolorimetrické enzymatické testy, čelí různým výzvám v citlivosti, selektivitě a nepřímém měření. Pokud jde o stávající LC-MS/MS testy pro měření buněčného nebo tkáňového NAD+ a jeho metabolitů, stále existuje mnoho obtíží, které je třeba překonat, jako jsou prodloužené doby běhu, špatné chování při zadržování chromatografie a neuspokojivé tvary vrcholů. Navíc tyto metody mohou být pokryty pouze jednou až třemi látkami v cestě záchrany NAD+.Modifikace metody LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Kromě toho jsou podmínky MS optimalizovány tak, aby minimalizovaly rušivý signál NAD+ v cyklickém kanálu adenosin difosfátu ribózy (cADPR) při zachování odezvy cADPR a mononukleotidu nikotinamidu (NMN), přičemž napětí v rozstřiku iontů je 4000 V, teplota turbotopu 450 °C, plyn 1 50 psi, plyn 2 50 psi, závěs plyn 30 psi a plyn při srážce 12 psi.
Reprezentativní chromatogram nervových vzorků (normální vs. poraněné)
Všechny pět analytů dosahuje separace výchozích hodnot, kde cADPR je citlivým biomarkerem v neurodegeneračním modelu. V této situaci axotomie sedacího nervu vyvolává axonální degeneraci, což vede ke snížené hladině NAD+ a zvýšené hladině NMN v poraněných nervech, což vede k přibližně dvojnásobnému zvýšení poměru NMN/NAD+. Současně se hladiny nikotinamidu (NAM) a adenosin difosfát-ribózy (ADPR) snížily přibližně dvojnásobně, zatímco hladina cADPR se zvýšila více než osmkrát. Tyto výsledky jsou v souladu s dříve publikovanými výzkumy, které ověřují přesnost této upravené metody LS-MS/MS při kvantifikaci NAD+ a jeho metabolitů.
Závěr
Tato upravená metoda LC-MS/MS umožňuje efektivní základní separaci NAD+, NMN, NAM, ADPR a cADPR během krátké doby 5 minut, což přispívá k včasné diagnostice různých neurologických poruch a vývoji léků pro stárnutí a neurodegenerativní onemocnění.Reference
Ma Y, Deng L, Du Z. Vývoj a validace metody LC-MS/MS pro kvantifikaci metabolitů NAD+ a příbuzných metabolitů u myších sedacích nervů a její aplikace na zvířecím modelu s nervovým poraněním. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC od roku 2012 se věnuje výzkumu a vývoji, výrobě a prodeji surovin pro koenzymy a přírodní produkty, s vlastními továrnami, více než 170 globálními patenty a silným týmem výzkumu a vývoje. BONTAC má bohaté zkušenosti s výzkumem a vývojem a pokročilé technologie v biosyntéze NAD a jeho předchůdci (např. NMN a NR). Lze vybrat různé typy NAD, včetně NAD ER Grade (odstranění endoxinu), NAD Grade I (IVD/doplňky stravy/kosmetické prášky), NAD Grade II (API/meziprodukty) a NAD Grade IV (pokud je rozpustnost vyšší požadavka), které lze pořídit ve formě lyofilizovaného prášku nebo krystalického prášku. Čistota BONTAC NAD může přesáhnout 98 %.
