Kvantifikace NAD+ a jeho metabolitů v sedacích nervech myší
引言
Klíčové části nikotinamidadenindinukleotidu (NAD+) a jeho metabolitů ve stárnutí a neurodegeneraci byly široce uznávány. Pro podporu pokroku v biochemickém výzkumu a intervencích zaměřených na stárnutí a neurodegenerativní onemocnění má velký význam přesně kvantifikovat hladiny NAD+ a jeho metabolitů v záchranné dráze NAD+. Zde je robustní a přesná metoda LC-MS/MS použita ke kvantifikaci hladin NAD+ a jeho metabolitů v normálním a poraněném sedacím nervu myši.Omezení stávajících metod pro kvantifikaci NAD+ a jeho metabolitů
Tradiční metody pro kvantifikaci NAD+ a jeho metabolitů, jako jsou HPLC-UV, NMR, kapilární zónová elektroforéza nebo kolorimetrické enzymatické testy, čelí různým výzvám v citlivosti, selektivitě a nepřímém měření. Pokud jde o stávající testy LC-MS/MS pro měření NAD+ a jeho metabolitů v buňkách nebo tkáních, stále existuje mnoho obtíží, které je třeba překonat, jako jsou prodloužené doby běhu, špatné chromatografické retenční chování a neuspokojivé tvary píků. Navíc těmito metodami lze pokrýt pouze jednu až tři látky v záchranné dráze NAD+.Modifikace metody LC-MS/MS
Na základě stávajících testů LC-MS/MS jsou provedeny modifikace týkající se chromatografických podmínek, náhradní matrice a podmínek MS/MS. Konkrétně je 5 μM kyseliny methylenfosfonové použito jako aditivum do mobilní fáze, což výrazně podporuje intenzitu signálu a tvar píku. Vzhledem k relativně čisté a jednoduché povaze vzorků a jejich malé velikosti je testována ultračistá voda jako náhradní matrice. Místo hydrofilní interakční chromatografické kolony a hypercarb kolony je použita kolona Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, jejíž jedinečná technologie MaxPeak HPS s vysokým výkonem povrchu (pasivace vnitřní stěny kolony, eliminace kovového povrchu) umožňuje vysokou reprodukovatelnost, symetrii píků a základní separaci všech analytů.Kromě toho jsou optimalizovány podmínky MS, aby se minimalizoval interferenční signál NAD+ v kanálu cyklické adenosindifosfátribózy (cADPR) při zachování odezvy cADPR a nikotinamidmononukleotidu (NMN), s 4000V pro iontové sprejové napětí, 450℃ pro teplotu turbo ohřívače, 50 psi pro plyn 1, 50 psi pro plyn 2, 30 psi pro curtain plyn a 12 psi pro kolizní plyn.
Reprezentativní chromatogram vzorků nervů (normální vs. poraněný)
Všech pět analytů dosahuje základní separace, kde cADPR je citlivý biomarker v modelu neurodegenerace. Zde axotomie sedacího nervu indukuje axonální degeneraci, což vede ke snížené hladině NAD+ a zvýšené hladině NMN v poraněných nervech, což má za následek přibližně 2násobné zvýšení poměru NMN/NAD+. Současně jsou hladiny nikotinamidu (NAM) a adenosindifosfátribózy (ADPR) sníženy přibližně 2násobně, zatímco hladina cADPR je zvýšena více než 8násobně. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky dříve publikovaného výzkumu, což potvrzuje přesnost této modifikované metody LC-MS/MS při kvantifikaci NAD+ a jeho metabolitů.
Závěr
Tato modifikovaná metoda LC-MS/MS umožňuje účinnou základní separaci NAD+, NMN, NAM, ADPR a cADPR v krátkém čase běhu 5 minut, což přispívá k včasné diagnostice různých neurologických poruch a vývoji léků pro stárnutí a neurodegenerativní onemocnění.参考文献
Ma Y, Deng L, Du Z. Vývoj a validace metody LC-MS/MS pro kvantifikaci NAD+ a souvisejících metabolitů v sedacích nervech myší a její aplikace na zvířecí model poranění nervu. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACse od roku 2012 věnuje výzkumu a vývoji, výrobě a prodeji surovin pro koenzymy a přírodní produkty, s vlastními továrnami, více než 170 globálními patenty a silným výzkumným a vývojovým týmem. BONTAC má bohaté zkušenosti s výzkumem a vývojem a pokročilé technologie v biosyntézeNAD a jeho prekurzorů(např. NMN a NR). Existují různé typy NAD k výběru, zahrnující NAD ER Grade (odstranění endotoxinů), NAD Grade I (IVD/doplněk stravy/kosmetický surový prášek), NAD Grade II (API/meziprodukty) a NAD Grade IV (pokud existují vyšší požadavky na rozpustnost), které mohou být dodávány ve formě lyofilizovaného prášku nebo krystalického prášku. Čistota NAD od BONTAC může dosáhnout více než 98 %.
