Růstově spřahané enzymové inženýrství manipulací s regenerací redoxních kofaktorů

Stále širší škála chemikálií je nyní vyráběna z obnovitelných surovin prostřednictvím biotechnologických prostředků. Bioprocesy silně spoléhají na enzymatickou katalýzu pro efektivní produkci těchto sloučenin. Zajištění optimálního výkonu enzymů v požadovaném prostředí je proto velmi důležité pro udržitelnou produkci.

Vlastnosti jako specifita substrátu, katalytická rychlost a (termo)stabilita patří mezi několik klíčových faktorů, které je třeba optimalizovat pro efektivní enzymy řízené bioprocesy. Tato optimalizace může být časově náročná, nákladná a náročná, a proto jsou účinné a nákladově efektivní způsoby pro růstově spojený výběr; inženýrské enzymy s žádoucími vlastnostmi jsou velmi žádané.

Výhody využití selekce spojené s růstem jako formy selekce enzymů, která spočívá v propojení aktivity enzymu s růstem buňky. Tato metoda může být použita jako vysoce propustná selekční strategie a lze jej dosáhnout buď zajištěním, že růst závisí na syntéze produktu cílovým enzymem, nebo propojením aktivity enzymu s celkovým energetickým stavem buňky. Syntetická biologie může být použita k inženýrství kmenů vhodných pro růstově spřaženou selekci a nedávné pokroky se zaměřují na inženýrství kmenů postrádajících oxidované nebo redukované stavy redoxních kofaktorových párů, které mohou sloužit jako platformy pro inženýrství enzymů. Použití těchto platforem může urychlit vývoj vylepšených biokatalyzátorů a bioprocesů.

Výhody růstového propojení pomocí kofaktorové auxotrofie

Výhody použití kofaktorové auxotrofie jako selekční metody pro inženýrství enzymů zapojených do biosyntézy určitých chemikálií, jako jsou lipidy, biopaliva, plyny, organická rozpouštědla nebo polymerní sloučeniny. Tento přístup nabízí několik jedinečných výhod, včetně možnosti vybrat požadovaný produkt nezávisle na substrátu nebo produktu, což usnadňuje detekci zlepšené enzymatické aktivity a nabízí zobrazení pro detekci zvýšené enzymatické aktivity. Navíc je využití kofaktorových auxotrofů jako růstových vazebních platforem přínosné, protože všudypřítomná povaha redoxních kofaktorů v mikrobiálním metabolismu znamená, že inženýrské strategie mohou být laterálně přenositelné na jiné mikroby a enzymy mohou být přímo inženýrsky vytvářeny v prostředí požadovaného mikrobiálního hostitele. (znázorněno na obrázku 1)

Obrázek 1: Srovnání několika široce používaných screeningových/selekčních technik pro enzymové inženýrství

Mutanty postrádající oxidaci NADH

Oxidace NADH u E. coli může probíhat dvěma cestami, v závislosti na dostupnosti kyslíku. Za aerobních podmínek je NADH převážně oxidován dýcháním za účelem tvorby ATP, zatímco za anaerobních podmínek může být oxidován fermentačními cestami za vzniku laktátu a ethanolu. Mutované kmeny E. coli, které nemohou využívat smíšené fermentační dráhy pro oxidaci NADH během anaerobního růstu, byly použity k pohonu oxidačních drah NADH pro anaerobní syntézu různých chemikálií, jako jsou 2-methylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol a L-alanin. Tyto mutované kmeny byly také použity k inženýrství enzymů využitím podobných redoxních principů, což vedlo ke zlepšeným variantám. Výsledné kmeny lze použít k inženýrství dalších NAD(P)H-závislých enzymů a drah.

Mutanti postrádající redukci NAD+  

Wenk a kol. vytvořili kmen E. coli odstraněním genu dihydrolipoyldehydrogenázy (LPD), což vedlo k tomu, že kmen nebyl schopen generovat redukční sílu (NADH a NADPH) z metabolismu acetátu kvůli absenci aktivity pyruvátdehydrogenázy. To způsobilo, že kmen vykazoval auxotrofii pro snížení výkonu při aerobním pěstování na acetátu jako jediném zdroji uhlíku. (znázorněno na obrázku 2) Kmen mohl růst na acetátu, pokud byl doplněn horními glykolytickými substráty nebo při expresi NAD+-dependentních formate-, ethanol- nebo metanol-dehydrogenáz s příslušnými substráty. Kmen nebyl použit pro enzymové inženýrství a byl hodnocen pouze na redoxní kofaktor auxotrofii.
 

Obrázek 2: Centrální metabolismus 

Mutanty postrádající oxidaci NADPH

Existují dvě různé strategie pro indukci auxotrofie NADP+ u E. coli, které spoléhají na inženýrství glykolytické dráhy k nadměrné produkci NADPH. První strategie spočívá v odstranění nativního genu gapA a expresi heterologního NADP+-dependentního enzymu GAPDH, zatímco druhá strategie spočívá v přesměrování toku uhlíku přes pentózovo-fosfátovou dráhu. Výsledné kmeny nejsou schopny růst na glukóze, ale vykazují růst za různých podmínek, přičemž první kmen roste v anaerobních podmínkách a druhý v aerobních podmínkách s glycerolem jako substrátem. Tyto kmeny se používají k inženýrství enzymů s lepšími vlastnostmi, včetně specifity substrátu, katalytické aktivity a termostability.

Mutanti postrádající redukci NADP+

Tři různé bakterie, E. coli, P. putida a C. glutamicum, byly geneticky upraveny tak, aby byly NADPH-auxotrofické, což znamená, že pro růst vyžadují exogenní NADPH. V případě E. coli a C. glutamicum byly centrální metabolické enzymy vyřazeny, aby se zabránilo snížení NADP+, když byla glukóza poskytována jako zdroj uhlíku, zatímco u P. putida bylo k postupnému narušení sad cílových genů použito inženýrství asistované CRISPR/nCas9, aby se pochopily jejich zapojení do redoxního metabolismu. Kmeny NADPH-auxotrofní byly poté použity pro růstově spřahané enzymové inženýrství na základě kofaktorové specificity. Jedno kolo mutageneze s využitím E. coli přineslo dosud nejúčinnější a nejspecifičtější NADP+-závislou formatovou dehydrogenázu, zatímco P. putida a C. glutamicum představují první kmeny svého druhu, které lze použít pro tento typ inženýrství.

Mutanti postrádající redukci NMN+

Byl vyvinut systém výběru s růstovou vazbou, který propojuje cyklování kofaktorů a růst na základě nedostatku snížení NMN+. Byl použit kmen E. coli SHuffle, který nese delece ve dvou genech zapojených do produkce redukovaného glutathionu. Pomocí racionální mutageneze byla vyvinuta NMNH-dependentní glutathion reduktáza, která spojuje proces s cyklováním NMN+/NMNH, a NMN+-dependentní glukózdehydrogenáza byla použita k podpoře cyklování NMN+/NMNH kofaktorů a tím i růstu. Studie také poprvé aplikovala nekanonickou redoxní kofaktorovou auxotrofii pro růstově spřaženou enzymovou inženýrství, což vedlo k termostabilní variantě fosfit-dehydrogenázy s lepší katalytickou účinností a časovou stabilitou in vitro. Tato práce poskytuje užitečný kmen pro vývojově spřažené enzymové inženýrství, závislé na cyklu NMN+/NMNH a auxotrofní pro redukovaný stav nekanonického redoxního kofaktoru.

Potenciál růstové vazby prostřednictvím redoxních kofaktorů fungoval jako silný nástroj pro inženýrství biokatalyzátorů, zejména v kontextu udržitelné bioprodukce. Ačkoli bylo dosaženo značného pokroku ve vytváření auxotrofických kmenů redoxního kofaktoru, prohlášení naznačuje, že stále existuje několik neprozkoumaných výzkumných cest. Jedním z nich je inženýrství auxotrofních kmenů kofaktorů organismů jiných než E. coli, což by mohlo otevřít nové možnosti pro vývojově spřahané enzymy.

Celkově naznačuje, že použití růstového vazby založeného na redoxních kofaktorech představuje významnou příležitost pro inženýrství biokatalýzy, zejména pro výrobu produktů, které nemohou splnit požadavky jiných vysokokapacitních přístupů k inženýrství enzymů. Zdůrazňuje potřebu vyvíjet všestrannější a účinnější biokatalyzátory pro udržitelnou bioprodukci a zdůrazňuje důležitost pokračujícího výzkumu v této oblasti.


Reference: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.