Růstově vázané enzymové inženýrství prostřednictvím manipulace s regenerací redoxního kofaktoru

Stále širší škála chemických látek se nyní vyrábí z obnovitelných vstupních surovin biotechnologickými prostředky. Bioprocesy se silně spoléhají na enzymatickou katalýzu pro účinnou výrobu těchto sloučenin. Zajištění optimálního výkonu enzymů v požadovaném prostředí je proto velmi důležité pro udržitelnou produkci.

Vlastnosti, jako je specifičnost substrátu, katalytická rychlost a (tepelná) stabilita, patří mezi několik kritických faktorů, které musí být optimalizovány pro účinné bioprocesy řízené enzymy. Tato optimalizace může být časově náročná, nákladná a náročná, a proto efektivní a nákladově efektivní způsoby, které pravděpodobně vedou k selekci spojenému s růstem, inženýrské enzymy s žádoucími vlastnostmi jsou velmi vyhledávané.

Výhody použití růstově vázané selekce jako formy selekce enzymů, která zahrnuje propojení aktivity enzymu s růstem buňky. Tato metoda může být použita jako vysoce výkonná strategie výběru a lze jí dosáhnout buď zajištěním závislosti růstu na syntéze produktu cílovým enzymem, nebo propojením aktivity enzymu s globálním energetickým stavem buňky. Syntetická biologie může být použita k inženýrství kmenů vhodných pro růstově vázanou selekci a nedávné pokroky se zaměřily na inženýrské kmeny s nedostatkem oxidovaných nebo redukovaných stavů redoxních kofaktorů, které mohou sloužit jako platformy enzymového inženýrství. Použití těchto platforem může urychlit vývoj vylepšených biokatalyzátorů a bioprocesů.

Výhody růstové vazby pomocí auxotrofie kofaktoru

Výhody použití kofaktorové auxotrofie jako metody výběru pro inženýrské enzymy podílející se na biosyntéze určitých chemických látek, jako jsou lipidy, biopaliva, plyny, organická rozpouštědla nebo polymerní sloučeniny. Tento přístup nabízí několik jedinečných výhod, včetně možnosti vybrat požadovaný produkt nezávisle na substrátu nebo produktu, který je předmětem zájmu, což usnadňuje detekci zlepšené enzymatické aktivity a nabízí odečet pro detekci zlepšené enzymatické aktivity. Použití auxotrotropů kofaktoru jako růstových spojovacích platforem je navíc výhodné, protože všudypřítomná povaha redoxních kofaktorů v mikrobiálním metabolismu znamená, že inženýrské strategie mohou být laterálně přenosné na jiné mikroby, které jsou předmětem zájmu, a enzymy mohou být přímo navrženy v prostředí požadovaného mikrobiálního hostitele. (znázorněno na obrázku 1)

Obrázek 1: Porovnání několika široce používaných screeningových/selekčních technik pro enzymové inženýrství

Mutanty s nedostatkem oxidace NADH

Oxidace NADH v E. coli může probíhat dvěma cestami v závislosti na dostupnosti kyslíku. Za aerobních podmínek je NADH oxidován hlavně dýcháním za vzniku ATP, zatímco za anaerobních podmínek může být oxidován fermentačními cestami za vzniku laktátu a ethanolu. Mutantní kmeny E. coli, které nejsou schopny používat smíšené fermentační cesty pro oxidaci NADH během anaerobního růstu, byly použity k pohonu oxidačních cest NADH pro anaerobní syntézu různých chemikálií, jako je 2-methylpropan-1-ol, 2,3-butandiol, 1-butanol a L-alanin. Tyto mutantní kmeny byly také použity k inženýrství enzymů využitím podobných redoxních principů, což vedlo k vylepšeným variantám. Výsledné kmeny mohou být použity k inženýrství dalších enzymů a drah závislých na NAD(P)H.

Mutanti s nedostatečnou redukcí NAD+

Wenk a kol. vytvořili kmen E. coli odstraněním genu dihydrolipoyldehydrogenázy (lpd), což vedlo k tomu, že kmen nebyl schopen generovat redukční energii (NADH a NADPH) z metabolismu acetátu kvůli absenci aktivity pyruvát dehydrogenázy. To způsobilo, že kmen vykazoval auxotrofii pro snížení výkonu, když rostl aerobně na acetátu jako jediném zdroji uhlíku. (znázorněno na obrázku 2) Kmen byl schopen růst na acetátu, když byl doplněn horními glykolytickými substráty nebo při expresi NAD+ závislých mravenčanů, ethanol- nebo methanoldehydrogenáz s příslušnými substráty. Kmen nebyl použit pro enzymové inženýrství a byl hodnocen pouze z hlediska auxotrofie redoxního kofaktoru.
 

Obrázek 2: Centrální metabolismus

Mutanty s nedostatkem oxidace NADPH

Existují dvě různé strategie pro indukci auxotrofie NADP+ u E. coli, které se spoléhají na inženýrství glykolytické dráhy k nadprodukci NADPH. První strategie zahrnuje odstranění nativního genu gapA a expresi heterologního enzymu GAPDH závislého na NADP+, zatímco druhá strategie zahrnuje přesměrování toku uhlíku pentózovou fosfátovou cestou. Výsledné kmeny nejsou schopny růst na glukóze, ale vykazují růst v různých podmínkách, přičemž první kmen roste za anaerobních podmínek a druhý za aerobních podmínek s glycerolem jako substrátem. Tyto kmeny se používají pro inženýrství enzymů se zlepšenými vlastnostmi, včetně specificity substrátu, katalytické aktivity a termostability.

Mutanti s nedostatečnou redukcí NADP+

Tři různé bakterie, E. coli, P. putida a C. glutamicum, byly navrženy tak, aby byly NADPH-auxotrofní, což znamená, že vyžadují exogenní NADPH pro růst. V případě E. coli a C. glutamicum byly centrální metabolické enzymy vyřazeny, aby se zabránilo snížení NADP+, když byla glukóza poskytnuta jako zdroj uhlíku, zatímco u P. putida bylo inženýrství asistované CRISPR / nCas9 použito k narušení sad cílových genů postupně, aby se pochopilo jejich zapojení do redoxního metabolismu. NADPH-auxotrofní kmeny byly poté použity pro enzymové inženýrství vázané na růst založené na kofaktorové specificitě. Jediné kolo mutageneze s použitím E. coli poskytlo dosud nejúčinnější a nejspecifičtější NADP+ dependentní mravenčandehydrogenázu, zatímco P. putida a C. glutamicum představují první kmeny svého druhu, které mohou být použity pro tento typ inženýrství.

Mutanti s nedostatečnou redukcí NMN+

Byl vyvinut systém selekce vázané na růst, který propojuje cyklování kofaktorů a růst založený na nedostatku snížení NMN+. Byl použit kmen E. coli SHuffle, který nese delece ve dvou genech podílejících se na produkci redukovaného glutathionu. NMNH-dependentní glutathion reduktáza byla vyvinuta prostřednictvím racionální mutageneze, aby spojila proces s cyklem NMN+/NMNH, a NMN+-dependentní glukózová dehydrogenáza byla použita k podpoře cyklu kofaktoru NMN+/NMNH a tím růstu. Studie také poprvé použila nekanonický redoxní kofaktor auxotrofie pro enzymové inženýrství vázané na růst, což vedlo k termostabilní variantě fosfitdehydrogenázy se zlepšenou katalytickou účinností a časovou stabilitou in vitro. Práce poskytuje užitečný kmen pro růstově vázané enzymové inženýrství, závislé na cyklování NMN+/NMNH a auxotrofní pro redukovaný stav nekanonického redoxního kofaktoru.

 

Potenciál růstového propojení prostřednictvím redoxních kofaktorů fungoval jako mocný nástroj pro inženýrství biokatalyzátorů, zejména v kontextu udržitelné bioprodukce. Přestože bylo dosaženo značného pokroku ve vytváření redoxních kofaktorů auxotrofních kmenů, prohlášení naznačuje, že stále existuje několik neprozkoumaných cest výzkumu. Jedním z nich je inženýrství auxotrofních kmenů auxotrofních kmenů jiných organismů než E. coli, což by mohlo otevřít nové možnosti pro enzymové inženýrství vázané na růst.

Celkově to naznačuje, že použití růstové vazby založené na redoxním kofaktoru představuje velkou příležitost pro inženýrskou biokatalýzu, zejména pro výrobu produktů, které nemohou uspokojit požadavky jiných přístupů enzymového inženýrství s vysokou propustností. Zdůrazňuje potřebu vyvinout univerzálnější a účinnější biokatalyzátory pro udržitelnou bioprodukci a zdůrazňuje význam pokračujícího výzkumu v této oblasti.


Odkaz: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.