Optimalizace reakčních podmínek pro dosažení vysokého výtěžku Stevia rebaudioside d
Diety s vysokým obsahem cukru vedly k rostoucímu výskytu různých chronických onemocnění, včetně obezity, cukrovky, kardiovaskulárních onemocnění a hypertenze, což představuje významný globální problém pro veřejné zdraví. Stevia Rebaudioside D (Reb D), přírodní sladidlo získané z rostlin, si získala značnou pozornost jako náhrada cukru díky svému nulovému obsahu kalorií, intenzivní sladkosti a příjemnému chuťovému profilu.
Její omezená přítomnost u stevia rebaudiana Bertoni a problémy spojené s nízkou rozpustností a enzymatickou aktivitou rostlinné glykosyltransferázy však bránily jejímu širokému komerčnímu využití. V reakci na tyto problémy byla objevena nová glykosyltransferáza zvaná YojK, pocházející z Bacillus subtilis 168. Tato studie představuje geneticky modifikovanou bakteriální glykosyltransferázu, YojK-I241T/G327N, charakterizovanou vysokou rozpustností a katalytickou účinností, což nabízí velký potenciál pro průmyslovou výrobu Reb D.
Vývoj vysoce účinné metody pro produkci rebaudiosidu D pomocí kaskádové reakce enzymů YojK-I241T/G327N a AtSuSy.
To address the issue of low solubility in plant-derived glycosyltransferases, researchers investigated the potential of using YojK, an O-glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168. YojK was chosen because of its demonstrated glycosylation activity with various substrates, including large molecules. After successful recombinant expression and purification, YojK was employed to glycosylate Reb A, resulting in the production of Stevia Reb D. Enzyme kinetic analysis revealed that YojK has lower catalytic activity toward Reb D compared to other glycosyltransferases. Consequently, the study suggests the necessity for structure-guided engineering to enhance YojK's catalytic activity for potential practical applications. (as shown in Obrázek 1)
Obrázek 1
Optimalizace reakčních podmínek pro dosažení vysokého výtěžku rebaudiosidu D.
The reaction conditions, including pH, temperature, and substrate concentration, can be optimized to achieve a high yield of Srevia Reb D. The study used molecular dynamics simulations to investigate how the YojK-I241T/G327N variant enhances Reb D glycosylation. The variant maintained a stable hydrogen bond between Reb A and H14 during simulations, unlike the wild-type(as shown in Obrázek 2). This stability also extended to the distance between Reb A's O2 atom and UDPG's C1P. The YojK-I241T/G327N variant's improved catalytic efficiency was attributed to these stable interactions, suggesting its practical potential.
Obrázek 2
Obrázek 3
Závěr
Tento přístup přinesl 83,47 % Reb D. Pozoruhodné je, že přidání 1 mM UDPG umožnilo syntézu 20,59 g/L Reb D s pozoruhodným výnosem 91,29 %, čímž překonal předchozí studie. Tento proces ukazuje potenciál průmyslové výroby Reb D, zejména po konstrukčním inženýrství YojK.YojK lze efektivně exprimovat v E. coli BL21 (DE3) s vysokou rozpustností. Díky konstrukci řízené konstrukce byl vytvořen dvojitý mutant YojK-I241T/G327N, který umožnil velkovýrobu Reb D s výjimečným výnosem 91,29 % recyklací UDPG katalyzované sacharózovou syntázou AtSuSy. Tato studie představuje YojK-I241T/G327N jako slibný nástroj pro ekonomicky efektivní průmyslovou výrobu Reb D.
