Reakce na dosažení vysokého výtěžku Stevia Rebaudioside D (Reb D) od Reb A

Strava s vysokým obsahem cukru vedla k rostoucímu výskytu různých chronických onemocnění, včetně obezity, cukrovky, kardiovaskulárních onemocnění a hypertenze, což představuje významný globální problém pro veřejné zdraví. Stevia Rebaudioside D (Reb D), přírodní sladidlo získané z rostlin, získalo značnou pozornost jako náhražka cukru díky svému nulovému obsahu kalorií, intenzivní sladkosti a příjemnému chuťovému profilu.
Jeho omezená přítomnost ve stévii rebaudiana Bertoni a problémy spojené s nízkou rozpustností a enzymatickou aktivitou rostlinné glykosyltransferázy však brání jeho širokému komerčnímu použití. V reakci na tyto problémy byla objevena nová glykosyltransferáza zvaná YojK, pocházející z Bacillus subtilis 168. Tato studie představuje geneticky modifikovanou bakteriální glykosyltransferázu, YojK-I241T/G327N, charakterizovanou vysokou rozpustností a katalytickou účinností, která nabízí velký potenciál pro průmyslovou výrobu Reb D.

Vývoj vysoce efektivní metody pro produkci rebaudiosidu D pomocí kaskádové reakce enzymů YojK-I241T/G327N a AtSuSy.

Aby se vyřešil problém nízké rozpustnosti v rostlinných glykosyltransferázách, vědci zkoumali potenciál použití YojK, O-glykosyltransferázy z Bacillus subtilis 168. YojK byl vybrán kvůli své prokázané glykosylační aktivitě s různými substráty, včetně velkých molekul. Po úspěšné rekombinantní expresi a purifikaci byl YojK použit ke glykosylátu Reb A, což vedlo k produkci stévie Reb D. Enzymová kinetická analýza ukázala, že YojK má nižší katalytickou aktivitu vůči Reb D ve srovnání s jinými glykosyltransferázami. V důsledku toho studie naznačuje nutnost strukturálně řízeného inženýrství pro zlepšení katalytické aktivity YojK pro potenciální praktické aplikace. (jak je znázorněno na obrázku 1)

Obrázek 1

Optimalizace reakčních podmínek pro dosažení vysokého výtěžku rebaudiosidu D.

Reakční podmínky, včetně pH, teploty a koncentrace substrátu, lze optimalizovat pro dosažení vysokého výtěžku Srevia Reb D. Studie použila simulace molekulární dynamiky ke zkoumání, jak varianta YojK-I241T/G327N zvyšuje glykosylaci Reb D. Varianta udržovala stabilní vodíkovou vazbu mezi Reb A a H14 během simulací, na rozdíl od divokého typu (jak je znázorněno na obrázku 2). Tato stabilita se také rozšířila na vzdálenost mezi atomem O2 Reb A a C1P UDPG. Vylepšená katalytická účinnost varianty YojK-I241T/G327N byla přičítána těmto stabilním interakcím, což naznačuje její praktický potenciál.

Obrázek 2

Vědci využili kaskádovou reakci zahrnující enzymy YojK-I241T/G327N a AtSuSy. Klíčové optimalizační kroky zahrnovaly udržování pH na 8,0 v tlumivém roztoku fosforečnanu draselného, reakční teplotu 35 °C, 10% DMSO spolurozpouštědla a koncentraci sacharózy 400 mM. (jak je znázorněno na obrázku 3)

Obrázek 3

Závěr

Tento přístup přinesl 83,47% Reb D. Zejména přidání 1 mM UDPG umožnilo syntézu 20,59 g / l Reb D s pozoruhodným výtěžkem 91,29%, což překonalo předchozí studie. Tento proces demonstruje potenciál pro průmyslovou výrobu Reb D, zejména po statice YojK.
YojK může být účinně exprimován v E. coli BL21 (DE3) s vysokou rozpustností. Prostřednictvím strukturně naváděného inženýrství byl vytvořen dvojitý mutant YojK-I241T/G327N, který umožnil velkovýrobu Reb D s výjimečným výtěžkem 91,29% recyklací UDPG katalyzovaného sacharózovou syntázou AtSuSy. Tato studie představuje YojK-I241T/G327N jako slibný nástroj pro ekonomicky efektivní průmyslovou výrobu Reb D.