Kvantifikace NAD+ a jeho metabolitů v myších sedacích nervech

Úvod

Klíčové části nikotinamidadenindinukleotidu (NAD +) a jeho metabolitů při stárnutí a neurodegeneraci byly široce uznávány. Pro urychlení pokroku směrem k biochemickému výzkumu a intervencím zaměřeným na stárnutí a neurodegenerativní onemocnění má velký význam přesná kvantifikace hladin NAD+ a jeho metabolitů v záchranné cestě NAD+. Zde je aplikována robustní a přesná metoda LC-MS/MS ke kvantifikaci hladin NAD+ a jeho metabolitů v normálním a poraněném sedacím nervu myši.

Omezení stávajících metod pro kvantifikaci NAD+ a jeho metabolitů

Tradiční metody kvantifikace NAD+ a jeho metabolitů, jako je HPLC-UV, NMR, kapilární zónová elektroforéza nebo kolorimetrické enzymatické testy, čelí různým výzvám v oblasti citlivosti, selektivity a nepřímého měření. Pokud jde o stávající LC-MS/MS testy pro buněčné nebo tkáňové měření NAD+ a jeho metabolitů, stále existuje mnoho obtíží, které je třeba překonat, jako je prodloužená doba běhu, špatné chromatografické retenční chování a neuspokojivé tvary píků. Navíc těmito metodami lze pokrýt pouze jednu až tři látky v záchranné cestě NAD+.

Modifikace metody LC-MS/MS

Na základě stávajících LC-MS/MS testů jsou prováděny modifikace týkající se chromatografických podmínek, náhradní matrice a podmínek MS/MS. Konkrétně se jako přísada do mobilní fáze používá 5 μM kyseliny methylenfosfonové, která explicitně podporuje intenzitu signálu a tvar píku. Vzhledem k relativně čisté a jednoduché povaze nikdy vzorků a jejich malé velikosti se jako náhradní matrice testuje ultračistá voda. Namísto kolony pro kapalinovou chromatografii s hydrofilními interakcemi a hypercarb kolony se používá kolona Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, jejíž jedinečná vysoce výkonná povrchová technologie MaxPeak HPS (pasivace vnitřní stěny kolony, eliminace kovového povrchu) umožňuje vysokou reprodukovatelnost, symetrii píků a základní separaci všech analytů.Kromě toho jsou podmínky MS optimalizovány tak, aby minimalizovaly interferenční signál NAD+ v kanálu cyklické adenosindifosfátribózy (cADPR) při zachování odezvy cADPR a nikotinamid mononukleotidu (NMN), s 4000 V pro iontové sprejové napětí, 450 °C pro teplotu turbo ohřívače, 50 psi pro plyn 1, 50 psi pro plyn 2, 30 psi pro záclonový plyn a 12 psi pro srážkový plyn.

Reprezentativní chromatogram nervových vzorků (normální vs. poraněné)

Všech pět analytů dosahuje základní separace, kde je cADPR citlivým biomarkerem v modelu neurodegenerace. Zde axotomie sedacího nervu vyvolává axonální degeneraci, což vede ke snížení hladiny NAD+ a zvýšené hladině NMN v poraněných nervech, což má za následek asi 2násobné zvýšení poměru NMN/NAD+. Současně se hladiny nikotinamidu (NAM) a adenosindifosfátribózy (ADPR) snižují přibližně 2krát, zatímco hladina cADPR se zvyšuje více než 8krát. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky dříve publikovaného výzkumu, který ověřuje přesnost této modifikované metody LS-MS/MS při kvantifikaci NAD+ a jeho metabolitů.

Závěr

Tato modifikovaná metoda LC-MS/MS umožňuje efektivní základní separaci NAD+, NMN, NAM, ADPR a cADPR v krátkém běhu 5 minut, což přispívá k časné diagnostice různých neurologických poruch a vývoji léků na stárnutí a neurodegenerativní onemocnění.

Odkaz

Ma Y, Deng L, Du Z. Vývoj a validace metody LC-MS/MS pro kvantifikaci NAD+ a příbuzných metabolitů v myších sedacích nervů a její aplikace na zvířecím modelu poranění nervů. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821

BONTAC NAD

BONTACse od roku 2012 věnuje výzkumu a vývoji, výrobě a prodeji surovin pro koenzymy a přírodní produkty, s vlastními továrnami, více než 170 globálními patenty a silným výzkumným a vývojovým týmem. BONTAC má bohaté zkušenosti s výzkumem a vývojem a pokročilou technologii v oblasti biosyntézyNAD a jeho předchůdci(např. NMN a NR). Na výběr jsou různé typy NAD, které zahrnují stupeň NAD ER (odstranění endoxinů), stupeň NAD I (IVD/doplněk stravy/kosmetický surový prášek), stupeň NAD II (API/meziprodukty) a stupeň NAD IV (pokud je vyšší požadavek na rozpustnost), které mohou být poskytnuty ve formě lyofilizovaného prášku nebo krystalického prášku. Čistota BONTAC NAD může dosahovat více než 98 %.

Zřeknutí se

Tento článek vychází z odkazu v akademickém časopise. Příslušné informace jsou poskytovány pouze pro účely sdílení a učení a nepředstavují žádné lékařské poradenství. Pokud dojde k nějakému porušení, kontaktujte prosím autora pro smazání. Názory vyjádřené v tomto článku nereprezentují postoj společnosti BONTAC. Společnost BONTAC nebude za žádných okolností činěna odpovědnou za jakékoli nároky, škody, ztráty, výdaje nebo náklady vyplývající nebo vyplývající přímo nebo nepřímo z vašeho spoléhání se na informace a materiály na těchto webových stránkách.